বায়োক্যাটালিটিক ক্যাসকেডগুলি ম্যাক্রোসাইক্লিক পেপটাইড এনলিসিটাইড তৈরি করতে সক্ষম করে

MSD-এর তদন্তমূলক মৌখিক PCSK9 ইনহিবিটর, এনলিসিটাইড ডেকানোয়েট (MK-0616), হল প্রথম ওরাল ম্যাক্রোসাইক্লিক পেপটাইড PCSK9 ইনহিবিটর যা মানুষের মধ্যে উল্লেখযোগ্য LDL-C হ্রাস প্রদর্শন করে। এনলিসিটাইডটি মনোসাইক্লিক পেপটাইডের একটি mRNA ডিসপ্লে স্ক্রীন থেকে তৈরি করা হয়েছিল এবং পরবর্তীতে তিনটি ফিউজড ম্যাক্রোসাইকেল সমন্বিত একটি কাঠামো তৈরি করতে ননপেপটিডিক ক্রস-লিংকের মাধ্যমে স্থিতিশীল করা হয়েছিল। এই জটিল অক্টাপেপটাইডে 12টি অ্যামাইড বন্ড এবং একটি কেন্দ্রীয়, ছয়-কার্বন চেইন লিঙ্কার দ্বারা সংযুক্ত ছয়টি অপ্রাকৃতিক এবং দুটি প্রোটিনোজেনিক অ্যামিনো অ্যাসিড রয়েছে। প্রথাগত রাসায়নিক সংশ্লেষণের জন্য প্রয়োজন 43টি ধাপ, সুরক্ষা-গ্রুপ ম্যানিপুলেশন (প্রায় অর্ধেক সিন্থেটিক ধাপ), ক্রোমাটোগ্রাফিক বিশুদ্ধকরণ, এবং একটি অত্যন্ত পাতলা রুথেনিয়াম-অনুঘটক রিং-ক্লোজার মেটাথেসিস ধাপ, সীমাবদ্ধতা এবং স্থায়িত্ব।

কেমোএনজাইমেটিক ম্যানুফ্যাকচারিং ডেভেলপমেন্ট

এমএসডি বিজ্ঞানীরা এনলিসিটাইড ডেকানোয়েট (1) তৈরির জন্য একটি সংক্ষিপ্ত এবং অভিসারী কেমোএনজাইমেটিক প্রক্রিয়া তৈরি করেছেন যা অ্যামিনো অ্যাসিড লিগাসেস দ্বারা মনোমারের সরাসরি সংযোগ দ্বারা সক্ষম, যা বায়োক্যাটালিটিক পেপটাইড ফ্র্যাগমেন্ট লাইগেশন এবং এস্টেরেস এবং ইমিন রিডাক্টেস ব্যবহার করে ম্যাক্রোসাইক্লাইজেশনের সাথে মিলিত হয়।

মূল অর্জন

এটিপি-গ্র্যাপ লিগাসেস ব্যবহার করে তিন-এনজাইম ক্যাসকেড সমাবেশ

- থ্রি-এনজাইম ক্যাসকেড (দুটি ইঞ্জিনিয়ারড ATP-গ্র্যাপ লাইগাসেস + ATP রিসাইক্লিং) অরক্ষিত অ্যামিনো অ্যাসিড থেকে একটি টেট্রাপেপটাইড একত্রিত করে। ATP-গ্র্যাপ লাইগাসেস (বিশেষত ATP-নির্ভর অ্যামিনো অ্যাসিড ligases, AALs) হল এনজাইম যা শক্তির উৎস হিসাবে ATP ব্যবহার করে অরক্ষিত অ্যামিনো অ্যাসিড বা পেপটাইডগুলির মধ্যে অ্যামাইড বন্ড গঠনকে অনুঘটক করে। তাদের প্রক্রিয়াটি একটি মিশ্র অ্যানহাইড্রাইড মধ্যবর্তী মাধ্যমে এগিয়ে যায়, যা নিউক্লিওফিলিক অ্যামাইন বা সক্রিয় অ্যাসিল দাতাদের রক্ষাকারী গোষ্ঠীর প্রয়োজন ছাড়াই সরাসরি সংযোগের অনুমতি দেয়। এই সমীক্ষায়, গবেষকরা Bifidobacterium adolescentis (BaAAL) এবং প্রকৌশলী ভেরিয়েন্ট (Trp-BaAALEng এবং Phe-BaAALEng) থেকে একটি ATP-গ্র্যাপ লিগেজ ব্যবহার করেছেন বেছে বেছে দুটি অ-প্রাকৃতিক অ্যামিনো অ্যাসিড (ট্রিপটোফ্যান এবং ফেনিল্যালানাইন) একটি অ্যানালগ-এর সাথে একটি ডিপেপটাইড প্রসারিত করতে। এই লাইগাসের একটি সংকীর্ণ, সমাহিত ইলেক্ট্রোফাইল পকেট রয়েছে যা একক অ্যামিনো অ্যাসিডকে ইলেক্ট্রোফাইল (সি-টার্মিনাল সাবস্ট্রেট) হিসাবে গ্রহণ করে তবে এন-নিউক্লিওফাইল হিসাবে দীর্ঘ পেপটাইডগুলিকে মিটমাট করতে পারে। এই সিলেক্টিভিটি তাদের সি-টার্মিনাস থেকে এন-টার্মিনাস পর্যন্ত ক্রমিক, সুরক্ষা-গ্রুপ-মুক্ত পেপটাইড সমাবেশের জন্য আদর্শ করে তোলে। খাওয়া ATP ফসফেট দাতা হিসাবে সস্তা হেক্সামেটাফসফেট সহ পলিফসফেট কিনেজ (FbPPKWT) ব্যবহার করে পুনর্ব্যবহার করা হয়।

ইঞ্জিনিয়ারড এস্টেরেজ (RsEstEng) রেজিওসেলেক্টিভ ম্যাক্রোল্যাকটামাইজেশন

- ইঞ্জিনিয়ারড এস্টেরেজ (RsEstEng) উত্তরের খণ্ড (73% ফলন, 52-কেজি স্কেল) গঠনের জন্য রেজিওসেলেক্টিভ ম্যাক্রোল্যাক্টামাইজেশনকে অনুঘটক করে। RsEstEng একটি বন্য ধরনের কার্বক্সিলেস্টেরেজ (RsEst) থেকে উদ্ভূত হয়েছে যা Roseibacillus sp থেকে শনাক্ত করা হয়েছে। এর নেটিভ ফাংশন হল এস্টার বন্ডের হাইড্রোলাইসিস। নির্দেশিত বিবর্তনের মাধ্যমে, গবেষকরা এটিকে রেজিওসেলেক্টিভ ম্যাক্রোল্যাকটামাইজেশনের জন্য একটি অনুঘটক হিসাবে রূপান্তরিত করেছেন - একটি ম্যাক্রোসাইক্লিক অ্যামাইড বন্ডের গঠন - এনলিসিটাইডের উত্তরীয় খণ্ড (4) সংশ্লেষণে। এটি রৈখিক টেট্রাপেপটাইড (9) এর স্থিতিশীল, ভারী tert-butyl এস্টারকে অ্যাসিল দাতা হিসাবে গ্রহণ করে যাতে ম্যাক্রোসাইক্লিক পেপটাইড (4) একটি ইন্ট্রামলিকুলার অ্যামাইড বন্ড তৈরি করে। এটি কোনও সনাক্তযোগ্য অলিগোমার ছাড়াই নির্বাচনী সাইক্লাইজেশন অর্জন করেছে এবং শুধুমাত্র 0.8% এস্টার হাইড্রোলাইসিস উপজাত, এমনকি পূর্বের এনজাইমেটিক ক্যাসকেড থেকে উচ্চ আয়নিক শক্তির অবস্থার অধীনেও।

ইঞ্জিনিয়ারড থিওয়েস্টেরেজ (BlTEEng) আন্তঃআণবিক বন্ধন

- ইঞ্জিনিয়ারড থিওয়েস্টেরেজ (BlTEEng) এপিমারাইজেশন ছাড়াই উত্তর (4) এবং পূর্ব খণ্ডের (3) আন্তঃআণবিক বন্ধন সঞ্চালন করে। BlTEEng হল একটি থায়োস্টেরেজ (TE) ডোমেনের একটি পরিবর্তিত সংস্করণ যা মূলত Brevibacillus laterosporus (BlTE) এর ননরাইবোসোমাল পেপটাইড সিন্থেটেস (NRPS) থেকে বের করা হয়েছে। এনআরপিএস সিস্টেমে ওয়াইল্ড-টাইপ থিওয়েস্টেরেসগুলি সাধারণত ম্যাক্রোসাইক্লাইজেশনকে অনুঘটক করে বা থায়োস্টার বন্ডের মাধ্যমে ক্যারিয়ার প্রোটিন থেকে রৈখিক পেপটাইড নিঃসরণ করে। BlTE এর প্রকৌশলী ভেরিয়েন্টগুলি কিছু কার্যকলাপ দেখিয়েছিল কিন্তু একটি ডাইমেরিক উপজাতের পক্ষে ছিল। এনজাইম ইঞ্জিনিয়ারিং এনজাইমকে স্থানান্তরিত করে আন্তঃআণবিক বন্ধনকে অনুঘটক করার জন্য প্রাকৃতিক, হাইড্রোলিটিক্যালি লেবাইল থিওয়েস্টারের পরিবর্তে আরও স্থিতিশীল আইসোপ্রোপাইল অক্সোয়েস্টার ব্যবহার করে।

ফোর-এনজাইম ক্যাসকেড রিডাক্টিভ অ্যামিনেশন ম্যাক্রোসাইলাইজেশন

- ফোর-এনজাইম ক্যাসকেড (PsIREDEng, KsKREDEng, এবং cofactor রিসাইক্লিং এনজাইম StLDHWT, TvADHWT) একটি বাইসাইক্লিক ডায়ামিন (69% ফলন, 46-কেজি স্কেল) গঠনের জন্য হ্রাসমূলক অ্যামিনেশন ম্যাক্রোসাইক্লাইজেশন অর্জন করে। KsKREDEng হল Kyrpidia sp থেকে একটি ইঞ্জিনিয়ারড ketoreductase. এটি একটি বেনজিলিক অ্যালকোহল যৌগ (10) একটি ক্ষণস্থায়ী অ্যালডিহাইড (11) থেকে NAD+ এর উপর নির্ভরশীল অক্সিডেশনকে অনুঘটক করে। PsIRED হল Pseudogymnoascus sp থেকে একটি imine reductase. এটি NADPH-নির্ভর। PsIREDEng অ্যালডিহাইড (11) এবং বিদ্যমান অ্যামিনের রিডাক্টিভ অ্যামিনেশনকে সাইক্লিক ইমাইন (12) গঠনের জন্য অনুঘটক করে, তারপরে সেকেন্ডারি অ্যামাইন ম্যাক্রোসাইকেল (13) এ হ্রাস পায়। StLDHWT অক্সিডেটিভ ধাপের জন্য NAD+ পুনরুত্পাদন করে পাইরুভেটকে ল্যাকটেটে কমিয়ে, যখন TvADHWT রিডাকটিভ ধাপের জন্য এনএডিপিএইচ পুনরুত্পাদন করে আইসোপ্রোপ্যানলকে অ্যাসিটোনে অক্সিডাইজ করে।

ইঞ্জিনিয়ারড পিবিপি থিওয়েস্টেরেজের মাধ্যমে চূড়ান্ত ম্যাক্রোসাইক্লাইজেশন

- ওয়েস্টার্ন ফ্র্যাগমেন্টের সাথে রাসায়নিক মিলন (2), তারপরে ইঞ্জিনিয়ারড পেনিসিলিন-বাইন্ডিং প্রোটিন থিওয়েস্টেরেজ (SsPBP-TEEng), উচ্চ ঘনত্বে চূড়ান্ত ম্যাক্রোসাইকেল বন্ধ করে (70 g/L) - সাধারণ তরলীকরণ সীমাবদ্ধতা (প্রথাগত সংশ্লেষণে 5 g/L) অতিক্রম করে। সামগ্রিক প্রক্রিয়াটিতে তিনটি ক্যাসকেড ধাপ, 7টি প্রকৌশলী + 3টি সহায়ক এনজাইম, 39% সামগ্রিক ফলন, মাল্টিকিলোগ্রাম-স্কেল প্রদর্শন, >99% বিশুদ্ধতা, কোন ক্রোমাটোগ্রাফি এবং কোনো সুরক্ষা গোষ্ঠী নেই। এই কাজটি জটিল ম্যাক্রোসাইক্লিক পেপটাইড তৈরির জন্য একটি টেকসই, পরিমাপযোগ্য ব্লুপ্রিন্ট প্রদান করে, দক্ষতা এবং রোগীর অ্যাক্সেস উন্নত করার সময় নাটকীয়ভাবে ধাপের সংখ্যা এবং বর্জ্য হ্রাস করে।